基于dCas9-VP64（经典CRISPRa）的sgRNA设计策略
CRISPRa（CRISPR activation）是一类把CRISPR技术从基因敲断工具转成基因上调工具的策略。核心思想是用失活但能定位的dCas9把转录激活因子准确送到基因的启动子或其他调控元件上，从而增强目标基因的转录。与传统CRISPR-Cas9带来的双链断裂不同，CRISPRa更像是一个可编程的“转录开关”，常用于功能上调、基因组学筛选、合成生物学等场景。
dCas9-VP64是最常见的CRISPRa架构之一。它把dCas9与VP64（4×VP16激活片段）融合，利用sgRNA将复合物定位到目标基因附近。到位后，VP64招募转录共激活因子或转录起始复合体，从而提高启动子的活性，促成更多的转录起始事件。该系统构造简单、易于实现，但单一VP64的激活能力属于中等，对低表达或闭合染色质基因可能不足。
设计sgRNA靶向TSS附近
dCas9-VP64的工作原理决定了把它放在转录发起点附近最可能直接影响转录起始。实践中常用的经验窗口是相对于注释TSS的-50到-300bp（不同体系会有差异）。许多CRISPRa文库与筛选采用以TSS为中心的tiling设计，因为靠近TSS的定位更容易干预转录装置的装配。
设计sgRNA时应考虑的生物学因素
1. 确认主TSS：许多基因存在多个转录起始位点。优先使用可靠注释（如CAGE/FANTOM/Ensembl）确认主TSS，或针对多个主要TSS设计sgRNA。
2. 位置优先级：首选相对于主TSS的-50至-300bp区间；如果该区域缺乏合适PAM或活性位点，可扩展到更宽窗口并做tiling。
3. 染色质可及性：优先选择位于开放染色质（ATAC-seq/DNase-seq）或带有激活性组蛋白标记（例如H3K4me3）的位点；闭合染色质会显著降低激活效果。
4. 核小体与转录因子位点：核小体密集或被关键抑制因子覆盖的位置可能阻碍dCas9结合或功能发挥，应尽量避开或在不同位点测试。
5. PAM与Cas变体：依据所用Cas9的PAM（如SpCas9的NGG）寻找候选；若目标窗口内没合适PAM，可考虑识别更宽PAM的Cas变体。
6. 序列打分与off-target：使用成熟的打分模型筛选高潜力sgRNA，同时运行off-target预测以避免误触发其它基因表达。
7. 链偏好与方向性：在哺乳动物体系中，靶向正反链通常都可工作，方向不是绝对决定因素，但记录链信息便于后续分析。
8. 转录本选择性：考虑目标基因是否有多个转录本及其生物学意义，设计时明确希望激活的转录本或覆盖所有转录本。
9. 细胞系差异：同一sgRNA在不同细胞系表现可能差异很大；如果可能，在目标细胞系上的组学数据能显著提升设计命中率。
实用的设计原则与流程
1. 确定目标与注释：明确目标基因、物种与参考基因组/注释版本，获取主TSS信息。
2. 确定设计窗口：在推荐窗口（首选-50至-300bp）内检索满足PAM的候选位点；若必要，扩展到-800到+200等更宽范围做tiling。
3. 候选筛选与打分：用CRISPR打分工具评估on-target活性、GC含量及潜在二级结构，优先选择高评分且不互相重叠的序列。
4. off-target过滤：对候选进行基因组比对，剔除与其他重要基因高相似性的sgRNA，保留特异性较好者。
5. 多位点策略：为每个基因准备多（通常≥2–4，理想3–6）个独立sgRNA；实验中可将若干sgRNA池化或并用以提高激活成功率。
6. 结合组学数据优化：如有ATAC-seq/ChIP-seq数据，优先选择位于开放染色质或具有激活标记的位置；若没有，优先选择多个不同位点以覆盖不确定性。
7. 备选与对照设计：准备非靶向阴性对照、以及若要区分效应来源可设计靶向不同TSS或增强子的sgRNA作为对比。
8. 实验验证与迭代：在小规模实验中先验证若干候选，依据实际上调幅度和特异性筛选最佳sgRNA，再扩大使用或组合。
多sgRNA与放大策略
单个sgRNA的激活效率受局部序列、核小体占位与转录因子结合等影响很大，因此同时使用多个sgRNA（叠加或池化）通常能提高激活幅度与成功率。若VP64强度不足，还可以采用更强的激活器（如VPR）、SAM（通过sgRNA的结构招募额外激活域）或SunTag（放大激活域招募次数）等策略。
优点、局限与实战注意事项
CRISPRa的优点在于可编程、无需DNA切割且不改变基因序列；但其激活效果依赖细胞类型与染色质状态，同一位点在不同细胞系表现可能不同。注释错误或忽视转录本多样性会导致设计失败；脱靶启动与对多转录本选择性不足也需注意。实验中应设置合适对照并记录所有设计参数以便结果解读与重复。
应用举例与扩展
CRISPRa可用于获得性基因筛选、调控通路构建、合成生物学中的开关设计以及治疗性基因表达研究（概念验证）。对于难以直接上调的基因，靶向其关键增强子或改变增强子–启动子相互作用也是可行的替代策略。