液体活检DNA甲基化标志物在肿瘤诊治中的实践与挑战
在现有FDA批准或商业可用的用于肿瘤管理的DNA甲基化液体活检测试中，大多数依赖于定量甲基化特异性PCR（qMSP）。基于PCR的方法因其可靠性和精确性，长期以来被认为是DNA甲基化生物标志物研究中靶向分析的金标准。此外，PCR平台在诊断实验室中广泛可用且成熟，使其成为临床应用中的实用选择。而且，qMSP允许对大型临床样本系列进行高通量分析。然而，在复杂背景中检测极其罕见的改变可能需要更灵敏的方法，如数字PCR（dPCR）。据报道，dPCR技术的检测限（LOD）显著更低，约为0.001%，而qPCR约为0.1%。这种增加的灵敏度是通过将样本分割成数千个分区，每个分区内运行独立的PCR反应来实现的。分区显著减少了背景DNA的竞争，并提高了罕见事件的检测。此外，dPCR技术的最新进展允许进行多重分析，即在一个反应中同时分析多个靶标。这种能力对于液体活检分析尤其有价值，因为目标DNA的量通常有限。尽管目前FDA批准的用于肿瘤管理的DNA甲基化测试均非基于dPCR，但该方法显示出未来临床应用的潜力。
基于PCR的靶向方法仅限于分析少量生物标志物，而NGS允许检测更大的生物标志物组合，从而 potentially 提高测试准确性。一些最灵敏的基于NGS的方法，如全基因组测序，其估计LOD约为0.001%，其灵敏度优于qPCR，并与dPCR在检测罕见改变方面相当。NGS广泛用于生物标志物发现，但其在常规临床实践中的应用迄今仍受高成本和复杂数据分析的限制。然而，测序技术和生物信息学的进步为更多靶向液体活检NGS测试获得FDA批准和/或商业化用于肿瘤管理开辟了新的可能性。例如，基于血液的Shield测试（Guardant Health）于2024年获FDA批准用于结直肠癌早期检测和筛查，它使用NGS检测一个包含DNA甲基化、突变和片段化模式的多标志物组合。
重要的是，生物标志物发现方法的选择可能影响下游靶向分析的兼容性。稳健的qMSP和dPCR检测通常要求靶序列具有高CpG密度，以充分区分甲基化和非甲基化位点，这使得它们非常适合通过甲基化组测序平台识别的生物标志物。相比之下，将微阵列衍生的生物标志物转化为qMSP或dPCR检测可能更具挑战性，因为微阵列探针通常靶向CpG含量较低的区域。微阵列数据的验证可以改用例如焦磷酸测序在单个CpG位点上进行。然而，焦磷酸测序提供的分辨率和灵敏度低于dPCR，因此不太适合通常需要高分析性能的液体活检应用。
靶向分析的标准化
无论采用何种靶向方法，确保每一步的高质量和标准化都将提高生物标志物测试实现临床效用的可能性。首先，生物标志物检测所靶向的CpG位点的精确选择很重要，因为它能显著影响观察到的DNA甲基化频率。例如，对结直肠癌中MAL基因启动子的研究报告了差异巨大的甲基化频率，范围从6%到80%。MAL在其启动子区域具有可变的DNA甲基化模式，不同靶向PCR检测中包含不同的CpG位点将导致不一致的结果。同一基因在同一肿瘤类型中甲基化频率的这种差异会降低生物标志物测试的临床价值。其次，基于PCR的DNA甲基化分析实验流程中的各种参数会影响甲基化值的一致性。其中，用于归一化或作为内参的选择尤为关键。由于肿瘤常以染色体畸变为特征，使用单拷贝基因作为归一化参考可能会给最终结果带来偏差。靶向多个位点的内参，如qPCR中的ALU序列或dPCR中的4Plex对照，已被证明可提高甲基化测量的一致性。特别是对于dPCR，直接影响最终甲基化浓度的另一步骤是分区分类，即将液滴分为阳性和阴性簇。已开发并比较了各种分区分类算法，应为每项研究仔细选择。值得注意的是，PoDCall算法专为dPCR平台上的DNA甲基化分析设计，并已被证明可提高此类分析的稳健性。
尽管文献中存在各种建议，但科学界对于靶向甲基化分析的标准化流程仍未达成共识。然而，MIQE指南的制定是提高基于PCR研究的透明度和质量的重要一步。这些指南已被广泛采纳，多家科学期刊要求作者提交标准化的MIQE表格。MIQE指南的实施显著提高了人们对在实验流程每一步保持质量重要性的认识。
对照组（靶向分析阶段）
为开发临床应用的生物标志物测试，选择合适的对照组至关重要。正如在生物标志物发现阶段所讨论的，对照组的选择取决于所研究的肿瘤类型和测试的预期临床应用。虽然最重要的对照通常在发现阶段就已纳入，但在靶向分析中也应纳入其他相关对照组。这些可能包括患有良性或炎症性疾病的患者、肿瘤高风险的无癌个体或其他肿瘤类型的患者。实现高生物标志物特异性通常需要在研究设计中纳入多个对照组，特别是对于液体活检，因为目标生物标志物常与其他组织的DNA片段和细胞共存。基于血液的肿瘤生物标志物在与健康对照比较时往往表现良好，但可能难以区分肿瘤与非癌性疾病，这凸显了识别可靠肿瘤检测生物标志物的挑战。对于基于尿液的生物标志物，针对其他泌尿系统肿瘤的特异性是自然的。然而，评估其相对于非泌尿系统恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌和结直肠癌）的性能也很重要，因为这些肿瘤类型的cfDNA也可能存在于尿液中。