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分子生物学实验技术复习资料
华北理工大学医学信息平台 2014-07-15 来源: 原创 点击数:15192
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磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片,有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。
原理:用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。
    80年代后, 发明了快原子轰击电离(FAB),电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。生物大分子可转变成气相离子。产生了生物质谱。
   软电离技术  离子化方式柔和,不裂解,可以分析非共价结合的生物大分子复合物,具有高分析速度和灵敏度。
根据生物质谱离子化方式的不同主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离,前者常采用四极杆质量分析器,所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪(ESI-MS),后者常用飞行时间作为质量分析器,所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。ESI-MS的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用,从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围,包括药物代谢、临床和法医学的应用等;MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高,且测样速度快,操作简单。此外,可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱(ion trap,IT)质谱和傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)质谱等。
1.电喷雾质谱技术:电喷雾质谱技术(Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如液一质联用(LC-MS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
2.基质辅助激光解吸附质谱技术:基质辅助激光解吸附质谱技术(MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。
3.快原子轰击质谱技术:快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebard-ment Mass Spectrometry ,FABMS)是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。
4.同位素质谱: 同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术,被广泛地应用于各个领域,但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,该化合物又易于用同位素标示,人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的,同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。

8.蛋白质组学的研究内容
 
9.图示操作基因的基本步骤
 
10.什么是工具酶,常用的工具酶,其功能是怎样的
工具酶是在基因工程中起到特定功能的酶的统称。
DNA限制性内切酶:生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。

11.基因操作的载体必须具备的特征是什么,常用的质粒载体有哪些
载体是指运载外源性DNA(目的基因DNA)有效地进入到受体细胞内的工具。
必须满足:①分子相对较小(3~10kb左右),能进行复制,且具有高拷贝数。
②具有几个单一的酶切位点,以便所要克隆的DNA片段能够连接、插入载体,酶切位点应该在载体的复制子以外适当的位置。
③外源性DNA插入后,载体在受体细胞中的复制不受影响。
④载体本身应对受体细胞无害,以及能接纳尽可能大的外源性DNA片段。
⑤有便于筛选的明显标志,如耐药性、空斑形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出。容易从宿主细胞中分离纯化。
⑥具有促进外源性DNA表达的调控区。
⑦生物防护安全,不污染环境。
常用的质粒载体有:
大肠杆菌质粒(pBR系列质粒、pUC系列质粒载体、pBV220质粒)革兰阳性菌的质粒。


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